Трансфекция является важным методом в молекулярной биологии, которая позволяет внедрять иностранные нуклеиновые кислоты в клетки, что позволяет исследователям изучать функцию генов, экспрессию белка и клеточные сигнальные пути. Клетки TET-213, клеточная линия нейробластомы человека, обычно используются в исследованиях нейробиологии из-за их нейрональных свойств. В этом сообщении я поделюсь некоторыми взглядами на то, как эффективно трансфицировать клетки TET-213, опираясь на мой опыт в качестве поставщика клеток TET-213.
Понимание клеток TET-213
Прежде чем углубляться в процесс трансфекции, важно понять характеристики клеток TET-213. Эти клетки получены из нейробластомы человека и демонстрируют особенности нейронов, такие как способность расширять нейриты и экспрессировать нейрональные маркеры. Они представляют собой прилипшие клетки, которые хорошо растут в стандартных условиях культивирования клеток, обычно в среде, дополненной сывороткой бычьей плода (FBS) и антибиотиками.
Выбор правильного метода трансфекции
Существует несколько методов для трансфекции ячеек, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения. Выбор метода трансфекции зависит от различных факторов, включая тип нуклеиновой кислоты, которая должна быть трансфицирована, типа клеток и желаемой эффективности трансфекции. Вот некоторые общие методы трансфекции, подходящие для клеток TET-213:
Липидная трансфекция
Трансфекция на основе липидов является одним из наиболее широко используемых методов для введения нуклеиновых кислот в клетки. Он включает в себя использование липидных реагентов, которые образуют комплексы с нуклеиновой кислотой, которые затем поглощаются клетками посредством эндоцитоза. Трансфекция на основе липидов относительно легко выполнить и может достичь высокой эффективности трансфекции во многих типах клеток, включая клетки TET-213.
Электропорация
Электропорация - это физический метод, который использует электрическое поле для создания временных пор в клеточной мембране, что позволяет нуклеиновой кислоте войти в клетки. Этот метод особенно полезен для трансфекции клеток, которые трудно трансфектировать с использованием других методов, таких как первичные клетки. Тем не менее, электропорация может быть более поврежденным для ячеек и может потребовать оптимизации параметров электропорации для достижения высокой эффективности трансфекции.
Вирусная трансдукция
Вирусная трансдукция включает в себя использование вирусных векторов для доставки нуклеиновой кислоты в клетки. Вирусные векторы получены из вирусов, которые были разработаны для переноса желаемой нуклеиновой кислоты и могут эффективно заразить клетки. Вирусная трансдукция может достичь высокой эффективности трансфекции и может использоваться для трансфекции широкого диапазона типов клеток, включая клетки TET-213. Тем не менее, вирусная трансдукция требует специализированного оборудования и опыта, и существуют потенциальные проблемы безопасности, связанные с использованием вирусных векторов.
Подготовка клеток для трансфекции
Правильный подготовка клеток имеет важное значение для успешной трансфекции. Вот несколько шагов, которые следует следовать при приготовлении клеток TET-213 для трансфекции:
Клеточная культура
Поддерживайте клетки TET-213 в подходящей среде для культивирования клеток, дополненной FBS и антибиотиками. Пропускается клетки регулярно, чтобы поддерживать их экспоненциальную фазу роста. Важно использовать здоровые, активно растущие клетки для трансфекции, поскольку клетки в плохом физиологическом состоянии могут иметь более низкую эффективность трансфекции.
Посев клеток
Засеите клетки TET-213 в культурной блюде или многопринятой пластине при соответствующей плотности. Плотность посева зависит от метода трансфекции и типа эксперимента. Для липидной трансфекции обычно рекомендуется плотность посева 50-80% слияния.
Клеточная инкубация
Инкубируйте поселенные клетки в увлажненном инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2 в течение не менее 24 часов до трансфекции, чтобы клетки могли прикрепляться и восстанавливать от процесса посева.
Выполнение трансфекции
Как только клетки приготовлены, пришло время выполнить трансфекцию. Вот общий протокол для трансфекции липидов клеток TET-213:
Подготовьте реагент трансфекции
Следуйте инструкциям производителя, чтобы подготовить реагент трансфекции на основе липидов. Как правило, это включает в себя разбавление реагента в подходящей среде трансфекции.
Приготовьте нуклеиновую кислоту
Приготовьте нуклеиновую кислоту, чтобы трансфицировать, например, плазмидную ДНК или миРНК. Разбавьте нуклеиновую кислоту в подходящей трансфекционной среде.
Сформировать комплекс трансфекции
Смешайте разбавленный реагент трансфекции и разбавленную нуклеиновую кислоту в трубке и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15-30 минут, чтобы обеспечить образование трансфекционного комплекса.
Добавить комплекс трансфекции в клетки
Удалите культуральную среду из клеток и замените ее свежей трансфекционной средой. Добавьте комплекс трансфекции в клетки с точки зрения капли и аккуратно закрутите пластину, чтобы равномерно распределить комплекс.
Инкубировать клетки
Инкубируйте трансфицированные клетки в увлажненном инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2 в течение соответствующего времени, в зависимости от типа нуклеиновой кислоты и эксперимента. Для трансфекции плазмиды ДНК времени инкубации 24-48 часов обычно достаточное для экспрессии генов.
Оценка эффективности трансфекции
После трансфекции важно оценить эффективность трансфекции, чтобы определить, была ли трансфекция успешной. Существует несколько методов для оценки эффективности трансфекции, в том числе:
Флуоресцентная микроскопия
Если трансфицированная нуклеиновая кислота кодирует флуоресцентный белок, такой как GFP, флуоресцентная микроскопия может использоваться для визуализации трансфицированных клеток. Процент флуоресцентных клеток может использоваться в качестве оценки эффективности трансфекции.
Проточная цитометрия
Проточная цитометрия может использоваться для количественной оценки процента трансфицированных клеток на основе экспрессии флуоресцентного маркера или антигена клеточной поверхности. Этот метод обеспечивает более точную и количественную меру эффективности трансфекции по сравнению с флуоресцентной микроскопией.
Вестерн -блоттинг или QPCR
Если трансфицированная нуклеиновая кислота кодирует белок, представляющий интерес, вестерн -блоттинг или КПЦР можно использовать для выявления экспрессии белка на уровне белка или мРНК, соответственно. Этот метод может предоставить информацию о уровне экспрессии генов и функциональности трансфицированного белка.
Устранение неполадок с общими проблемами трансфекции
Трансфекция иногда может быть сложной задачей, и есть несколько общих проблем, которые могут возникнуть. Вот несколько советов по устранению неполадок для общих задач трансфекции:
Низкая эффективность трансфекции
- Проверьте качество и количество нуклеиновой кислоты. Убедитесь, что нуклеиновая кислота является чистой и высоким качеством.
- Оптимизируйте условия трансфекции, такие как концентрация реагента трансфекции, соотношение нуклеиновой кислоты к отростке и время инкубации.
- Проверьте здоровье клеток и жизнеспособность. Убедитесь, что клетки здоровы и активно растут перед трансфекцией.
- Попробуйте другой метод трансфекции или реагент.
Клеточная токсичность
- Уменьшить концентрацию реагента трансфекции или нуклеиновой кислоты.
- Оптимизируйте условия трансфекции, чтобы минимизировать повреждение клеток.
- Используйте другой метод трансфекции или реагент, который менее токсичен для клеток.
Эффективность переменной трансфекции
- Убедитесь, что клетки высевают равномерно и при соответствующей плотности.
- Тщательно смешайте комплекс трансфекции, прежде чем добавить его в ячейки.
- Инкубируйте ячейки в постоянных условиях, чтобы минимизировать изменчивость.
Заключение
Трансфекция клеток TET-213 может быть сложным, но полезным процессом. Выбирая правильный метод трансфекции, правильно подготовя клетки и следуя соответствующему протоколу, вы можете достичь высокой эффективности трансфекции и получить надежные результаты. Если у вас есть какие-либо вопросы или вам нужна дополнительная помощь с трансфекцией клеток TET-213, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам. Мы являемся ведущим поставщиком клеток TET-213 и можем предоставить вам высококачественные ячейки, реагенты-трансфекции и техническую поддержку.
В дополнение к клеткам TET-213, мы также предлагаем широкий спектр пептидов, включаяГаланан (человек)ВCyclo (RGDFC), иDynorphin A (1-13), амид, свиньиПолем Эти пептиды могут использоваться в различных исследованиях исследований, таких как нейробиология, исследования рака и открытие лекарств.
Если вы заинтересованы в покупке клеток TET-213 или любого из наших пептидов, свяжитесь с нами, чтобы обсудить ваши конкретные потребности. Мы с нетерпением ждем возможности работать с вами и помогать вам в достижении ваших целей исследования.
Ссылки
- Sambrook, J. & Russell, DW (2001). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA, & Struhl, K. (Eds.). (2002). Текущие протоколы в молекулярной биологии. Джон Уайли и сыновья.
- Chen, C. & Okmama, H. (1987). Высокоэффективная трансформация клеток млекопитающих плазмидной ДНК. Молекулярная и клеточная биология, 7 (8), 2745-2752.
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y. & Hofschneider, PH (1982). Передача гена в мышиные клетки лийомы путем электропорации в высоких электрических полях. Embo Journal, 1 (7), 841-845.
- Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, FH, ... & Verma, IM (1996). Доставка гена in vivo и стабильная трансдукция недивирующих клеток лентивирусным вектором. Science, 272 (5259), 263-267.